مقدمـة :
لقد ذكر الجنس Trichoderma منذ أكثر من مائة عام ، وذلك من قبل العالم Persoon. يتكون هذا الجنس من مجموعة فطريات مترادفة الأسماء ، تعزل من التربة ومن المواد العضوية المتحللة. عزلات هذا الفطر شائعة الانتشار ، ومن السهولة عزلها وتربيتها في بيئة غذائية. بالإضافة لذلك فإن هذه العزلات تنمو بسرعة على كثير من المواد الغذائية المختلفة ، وتنتج مضادات حيوية تكون نتيجة التمثيل الغذائي ، كذلك فإن هذه العزلات يمكن أن تكون متطفلات على الفطريات الأخرى Mycoparasitic ضد مجال واسع من الكائنات الممرضة .
إن ظاهرة التطفل على الفطريات ، وكذلك إنتاج المضادات الحيوية ، قد ذكرت أول مرة في فطر Trichoderma بواسطة Weindling سنة (1932) و (1934). هناك تطبيقات تكنولوجية حديثة تستعمل فيها هذه الفطريات كعوامل مقاومة حيوية ، كلها اعتمدت على الأبحاث السابقة التي ذكرها ذلك العالم.
معظم أنواع جنس Trichoderma تنمو بسرعة على البيئة الغذائية الصناعية وتنتج أعداداً كبيرة من الجراثيم الكونيدية الصغيرة الخضراء أو البيضاء من خلايا تسمى Conidi-ogenous تقع في نهايات التفرعات العديدة للحوامل الكونيدية. هذه الصفات تسهل نسبياً عملية تعريف وتحديد الجنس Trichoderma ولكن تحديد الأنواع عملية صعبة جداً ، لأن هناك تداخلاً كبيراً بين صفات هذه الأنواع ، ويصعب وضع الاسم المحدد للنوع إلا بعد دراسة مستفيضة وواسعة .
لقد قسم العالم Rifai سنة (1969) هذا الجنس إلى تسعة أنواع ، حددت على أساس الصفات المورفولوجية ، إلا أن العالم Bisset سنة (1991) أعاد دراسة الجنس Trichoderma وأضاف إليه بعض Hypocrea ذات الأشكال المتقاربة ، وأدى ذلك إلى تقسيم هذا الجنس إلى خمسة مجموعات ، وبالتالي فإن مفهوم الأنواع ضمن هذا الجنس واسع جداً ، وهذا أدى إلى تقسيم الأنواع إلى Specific وآخر Subspecific هذا ما ذكره Samuels سنة (1996).
من أكثر أنواع الجنس Trichoderma تحديداً ومعرفة ، هي :
1- Trichoderma harzianum 2- T. viride 3- T.hamatum
4- T. polysporum 5- T. pseudokoningii 6- T. koningii
النوع الثالث والخامس تلائمها التربة عالية الرطوبة ، في حين أن النوع الثاني والرابع تلائمهما التربة ذات الحرارة المنخفضة ، أما النوع الأول يتواجد في المناطق الدافئة ، أما النوع الثالث والسادس فإنهما يتواجدان في ظروف المناخ المتقلب .
وسائل استخدام الفطر في المقاومة الحيوية :
1- معاملـة تربـة :
قبل سنة (1970) أجريت دراسات كثيرة على المقاومة الحيوية ، وذلك باستعمال الجنس Trichoderma على التربة ، وذلك لإحداث تغيرات في التجمعات الطبيعية للكائنات الحية في التربة أو في الأجزاء النباتية المحيطة بها التربة ، مما يؤدي إلى المقاومة الحيوية. لقد ذكر Bliss سنة (1951) أن مقاومة الفطر Armillaria mellea في الحمضيات بعد التبخير بمادة ثاني كبريت الكربون ، تعزى إلى التجمعات الطبيعية للفطر Trichoderma التي تنتشر بسرعة في التربة المعقمة ، ولكنه لم يضع تفسيراً لذلك ، لأن هذه التجمعات تكون هي السبب في مقاومة الكائن الممرض. ولقد ذكر أن الفطر Trichoderma ، أكثر مقاومة لمادة ميثايل برومايد عن الفطر الممرض A.mellea. ثم بعد ذلك ذكر العالم Chet سنة (1980-1981) أن الفطر Trichoderma يثبط نمو الفطر الممرض R.solani والفطر Pythium sp. ثم بعد ذلك حدث تطور كبير في تفهم المقاومة الحيوية .
بدأت المقاومة الحيوية التطبيقية في الحقل باستعمال الفطر Trichoderma بواسطة العالم Well et al., سنة (1982) ، وذلك باستعمال تحضيرات من الفطر تريكوديرما النامي على بيئة صلبة (حبوب ، شيلم أو قمح) وذلك للمقاومة الحقلية للفطر الممرض Sclerotium rolfsii على نبات الطماطم. هذا النظام من المقاومة يحتاج كميات كبيرة من المواد العضوية لينمو عليها الفطر المضاد (4200كغم/هكتار) لمقاومة المرض. إلا أن العالم Kabana استطاع أن يستعمل بعض المواد الحبيبية غير الذائبة (الداياتومات) المخلوطة مع المولاس لتنمية الفطر المضاد T.harzianum ، ثم تؤخذ هذه الحبيبات وتضاف على خطوط التربة المزروعة بحوالي 70-100 يوم ، وهذا يؤدي إلى مقاومة ناجحة للفطر S.rolfsii وأدى إلى زيادة إنتاج الفول السوداني لثلاث سنوات متتالية. ولقد تبين أن مقاومة المرض بهذه الطريقة تعادل المقاومة باستعمال المبيد الفطري PCNB.
عند تنمية الفطر T.harzianum على مواد صلبة وتنثر هذه المواد على التربة بالقرب من النباتات المزروعة ، أعطت مقاومة حيوية ناجحة ضد الأمراض الآتية :
1- العفن الأبيض في البصل المتسبب عن Sclerotium cepivorum في مصر والولايات المتحدة .
2- أمراض ذبول القطن والخيار المتسببة عن Verticillium dahliae في روسيا.
3- أمراض سقوط البادرات الرايزوكتوني ولفحة سكلوروشيم في كثير من المحاصيل في إسرائيل .
4- عفن الثمار الرايزوكتوني في الخيار في إسرائيل.
لقد ذكر Kelley أن إضافة مواد غذائية طازجة إلى التربة مع الفطر المضاد T.harzianum تشجع نمو الفطر الممرض Pythium وتساعد في زيادة استعماره للمواد العضوية ، وهذا يؤدي إلى زيادة حدوث المرض. لقد تم الحصول على مقاومة تامة للمرض عند إضافة الكائن المضاد على شكل كرات ، قبل زراعة بادرات الخيار المنقولة إلى الأرض الدائمة بحوالي 15-30 يوماً.
كذلك يمكن استعمال الجراثيم الكونيدية للفطر Trichoderma على شكل معلق تغمر فيه جذور شتلات الفراولة قبل زراعتها في الأرض الدائمة ، وهذا يؤدي إلى خفض حدوث الأمراض لهذه الشتلات. كذلك تم الحصول على مقاومة ممتازة لذبول الفيوزاريوم في الأقحوان سنة 1984 ، وذلك بإضافة مزيج من المعلق المائي للجراثيم الكونيدية للفطر T.viride مع المبيد الفطري البنليت ، حيث إن البيوتايب الفطري مقاوم للمبيد بنليت. تستعمل جراثيم الفطر المضاد بتركيز 10 4 جرثومة كونيدية/مل ، وتضاف للتربة بعد تبخيرها ببخار الماء على حرارة 82ْم لمدة ساعتين .
أثبتت الدراسات الحديثة بواسطة Beagle et al سنة (1984) وكذلك العالم Papavizas سنة (1984) ، أن التحضيرات الفطرية الناتجة من التخمرات بكميات كبيرة (FB) Fermentor Biomass والتي على شكل مسحوق وطين أو كرات من Alginate عند إضافتها إلى التربة ، فإنها تتكاثر بسرعة وتثبط المرض بكفاءة أكثر من استعمال الجراثيم الكونيدية العادية أو الجراثيم الكلاميدية. كذلك وجد أن الـ (FB) من فطريات T.viride و T.harzianum , T.hamatum تقلل وتثبط بقاء ونمو الفطر الممرض R.solani ، في التربة وتخفض مرض عفن ثمار الطماطم الناتج عن رايزوكتونيا
2- معاملـة بـذور :
يعتبر استعمال الفطر Trichoderma على البذور طريقة بديلة لإدخال الفطر في التربة بدلاً من استعماله مباشرة على التربة في التشكيلات المختلفة المذكورة سابقاً ، حيث إن هذه الطريقة تتطلب كمية قليلة من تحضيرات الفطر ، إذا قيست بالكميات التي توضع في التربة أو على شكل أكوام صغيرة .
لقد تم الحصول على مقاومة حيوية جيدة لسقوط البادرات المفاجئ في البسلة والفجل المتسبب عن الفطر R.solani والفطر Pythium ، وذلك بمعاملة البذور لكل من البسلة والفجل بالجراثيم الكونيدية للفطر T.hamatum ، وكذلك تم الحصول على مقاومة جيدة من البيوتايب الناتج عن استعمال الأشعة الفوق بنفسجية من الفطر T.harzianum و T.viride. وكذلك حصل تحسن كبير في نمو النباتات وزيادة إنتاج فول الصويا المزروع في تربة ملوثة بالفطر Rhizoctonia عند معاملة البذور بالفطر T.pseudokoningii ، وكذلك عند معاملة حبوب الذرة وفول الصويا بالفطر T.harzianum. إن استعمال الفطر الأخير كمعاملة بذور للقطن لمقاومة R.solani أعطى نتيجة جيدة في الحقل في إسرائيل .
هناك بعض الملاحظات يجب مراعاتها عند استعمال الجنس Trichoderma كمعاملة بذور ، وهي :
1- يجب أن يكون الفطر قادراً على التكاثر في التربة .
2- يجب أن يكون الفطر ذا مقدرة على التنافس في منطقة الرايزوسفير ، وذلك لتثبيط الكائن الممرض بالمنافسة أو بالتطفل الفطري أو التضاد الحيوي.
3- يجب أن يكون الفطر ذا تضاد حيوي وله القدرة على التجمع وتكوين مستعمرات في منطقة الرايزوسفير.
4- يجب أن يكون حساساً للسايدروفورز المفرزة من البكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى في التربة .
5- يمكن تحسين كفاءة هذا الجنس عن طريق التنقية والاختيار والهندسة الوراثية والتربة.
3- الاستعمال على المجموع الخضري :
كانت البداية الأولى في استعمال الفطر Trichoderma على المجموع الخضري ، هو حقن جروح أشجار العنب الأحمر بالفطر T.harzianum وهذا يمنع اختراق الجروح بفطريات الـ Hymenomycetes بعد 21 يوماً ، ولكن بعد 21 شهراً فإن 14% من الجروح المعاملة سببت زيادة في تجمعات هذه الفطريات ، وكان الكائن المضاد أقل فعالية عند استعماله في الشتاء. ونظراً لأن الفطر Trichoderma ضعيف في مقدرته على استعمار الخشب الحديث ، فإن تحسن تأثيره يكون بسبب الكميات الكبيرة من اللقاح التي تضاف إلى الجروح ، مما يساعد على تأسيس موقع مؤقت حيث أن سيطرته تفقد مع الزمن .
ومن الأمثلة الأكثر نجاحاً في المقاومة الحيوية باستعمال الجنس Trichoderma على الأجزاء الخضرية في النبات ، هو استعماله للمقاومة الحيوية للأمراض التي تدخل عن طريق الجروح في الأشجار والشجيرات ،وذلك عن طريق إضافة الفطر إليها وقت التقليم. لقد ذكر Grosclaude سنة 1970 أن كفاءة الفطر T.viride ضد الفطر Stereum purpureum ، الاسم القديم Chondrostereum مسبب مرض الورقة الفضية على البرقوق ، تكون عالية عند استعماله وقت التقليم. ولقد ابتكر هذا العالم سنة 1973 طريقة لاستعمال الجراثيم الكونيدية للفطر المضاد على الجروح أثناء القطع عن طريق استعمال مقصات خاصة للتقليم. في إحدى التجارب العملية وجد أن إضافة الكائن المضاد بهذه الطريقة ، قبل 48 ساعة من الحقن بالكائن الممرض يحمي شجرة البرقوق ذات عمر سنتين ، تماماً من المرض ، ولكن لا يعطي النتيجة نفسها إذا استعمل الكائن المضاد مع الكائن الممرض في الوقت نفسه.
لا يقتصر استعمال الفطر Trichoderma على منع المرض فقط ، ولكن أيضاً يمكن أن تكون هناك معاملات علاجية لمقاومة مرض الورقة الفضية باستعمال الفطر T.viride ، حيث يستعمل على أوتاد خشبية 0.8 × 10سم توضع في حفر على مسافات 10سم في جذع والأفرع الرئيسية لشجرة البرقوق المصابة بمرض الورقة الفضية ، أو الخوخ النكترين. استعملت هذه الطريقة في أوائل السبعينيات وأعطت نتائج كالآتي :
50% من الأشجار أعطت أعراضاً بسيطة من مرض الورقة الفضية (اختفت الأعراض بعد فترة قصيرة).
33% لم تعط أية أعراض.
71% لم تستجب لهذه المعاملة .
لقد أطلق العالم Ricard سنة 1977 اصطلاح Inmunizing Commensals على عوامل المقاومة الحيوية التي تحدث تأثيرات العلاج الحيوي وتحفظ أو تعالج النباتات من المرض دون أن تكون هي ممرضة. لقد كان هناك نجاح تام عند استعمال T.viride و T.polysporum لمقاومة مرض الورقة الفضية على الأشجار ، وذبول الفيرتسليم على عيش الغراب ، وقد سجل هذان النوعان تجاريا في فرنسا وبريطانيا. وبحلول 1981 كان هناك أكثر من عشرين ألف شجرة مثمرة قد عوملت تجارياً بالفطريات المذكورة.
لم يقتصر استعمال الجنس Trichoderma على الجروح فقط ، وإنما استعمله Tronsomo و Dennis سنة 1977 لحفظ ثمار الفراولة من مرض عفن المخزن المتسبب عن الفطر Mucor mucedo, Botryits cinerea عن طريق رش نباتات الفراولة في الحقل ابتداء من أول التزهير بمعلق مائي من الجراثيم الكونيدية لكل من T.viride و T.polysporum ، وكانت نتيجة المقاومة الحيوية تشبه نتيجة استعمال المبيد الفطري Dichlofluanid. كذلك أمكن حفظ ثمار الخوخ ضد مرض البقعة العينية المتسبب عن الفطر B.cinerea وذلك برش الجراثيم الكونيدية للفطر T.pseudokoningii بعد الحقن الصناعي للازهاز بالكائن الممرض وليس عند حدوث المرض من الحقن الطبيعي. إن قلة نجاح المقاومة الحيوية لهذا المرض عند حدوث الإصابة الطبيعية ، يكون بسبب درجة الحرارة المنخفضة السائدة وقت الإزهار. وجد أن الفطر المضاد T.pseudokoningii غير قادر على النمو على حرارة أقل من 9ْم ، بينما الفطر الممرض B.cinerea ، يمكن أن يعيش ويهاجم النبات على حرارة أقل 9ْم ، أما بالنسبة للفطر T.harzianum ، وجد أن رش جراثيمه الكونيدية على أزهار التفاح يخفض الإصابة بمرض البقعة العينية على الثمار ، وذلك لأن هذا الفطر يستطيع أن ينمو تحت درجات حرارة منخفضة ، كذلك وجد أن مقدرة الفطر T.harziamun ضد الفطر B.cinerea على العنب في الحقل تعتمد على درجة الحرارة وعلى تركيز اللقاح المستعمل من الجراثيم الكونيدية .
المضادات الحيوية التي يكونها الجنس Trichoderma
يبين شكل رقم (14) المضادات الحيوية التي يكونها فطر Trichoderma spp.
رقم 1 : Trichodermol ويفرزه الفطر T.polysporum
رقم 2 : Harzianum ويفرزه الفطر T.harzianum
رقم 3 : Harziandione ويفرزه الفطر T.harzianum
رقم 4 : 6-pentyl – 2- pytone ، ويفرزه الفطر T.harzianum السلالة المعروفة باسم (IMI275950). وجد أن هذا المركب فعال بتركيز 10 أجزاء في المليون ضد الفطر R.solani والفطر مسبب المرض الماحق في القمح. وهو يعطي مقاومة جيدة دون التأثيـر علـى النبـات وينطلـق ويتخلـل التربـة ، ويمكن أن يعمل كمدخـن متوسط الفاعليـة .
رقم 5 : Pyridone harzianopyridone وتفرزه السلالة (IMI من الفطر T.harzianum وهو يؤثر على الفطر Botryits cinerea ويؤثر على R.solani بتركيز 1ملغ/1مل.
رقم 6 : Butenolide , harzianolide ويفرزه T.harzianum تحت ظروف معينة .
رقم 7 : Polyketides ويفرزه الفطر T.harzianum تحت ظروف معينة .
**************
Trichoderma harzianum
ودوره فـي المقاومــة الحيويـة
مقدمــة :
يعتبر النوع harzianum من أهم الأنواع التابعة للجنس Trichoderma المستعمل في المقاومة الحيوية لأمراض النبات. يعتبر هذا النوع بأنه نوع متكتل Species aggregate والذي يحوي وفره كبيرة من السلالات ، التي يمكن أن تستعمل كعوامل مقاومة حيوية ضد الفطريات الممرضة للنبات. الوضع التقسيمي لهذا الفطر غامض (هذا رأي Grondona et al. سنة 1997). وإن الميزان المستعمل في تصنيف وتعريف السلالات لغاية 1997 لم يزودنا بطرق تمييز كافية ، خاصة مع تلك العزلات المهمة في برامج المقاومة الحيوية. هناك دراسات عديدة تهدف لوضع أوصاف لهذه الكائنات الحية الدقيقة ، تعتمد على أساس نشاطها فـي التضـاد مـع الفطريـات أو تضادها الحيوي أو تطفلها على الكائنات الأخرى أو باتحاد أي منهما.
لقد تم تقسيم T.harzianum إلى 3-5 مجموعات Sub specific وذلك اعتماداً على السلالات وعلى نوع الدراسة المتبعة. هناك حوالي 15 عزلة من هذا الفطر ، اعتمد في تقسيمها على 82 صفة مورفولوجية وفسيولوجية وبيوكيميائة وعلى 99 أيزوانزيم من سبعة نظم إنزيمية .
المجموعة الأولى : Cluster I
تسمى هذه المجموعة Cluster I وهي تحوي 70% من مجموع العزلات ، وهذه المجموعة تقسم إلى قسمين Ib , Ia .
المجموعة Ia : تشمل العزلات الموجودة في بريطانيا ذات أرقام 24 ، 2929 ، 26 ، 29 ، 2928 ، 2927 وتتميز بأنها ذات مقاومة حيوية جيدة في أسبانيا. جميع هذه السلالات لها Intercalary Chlamydospores وذات hydrolyzed gelatin وتنتج صبغات صفراء على بيئة MEA .
المجموعة الثانية Cluster II :
تشمل هذه المجموعة العزلات ذات الأرقام 260 ، 11 ، 3 ، 2923 وهي تنتشر في فرنسا وزمبابوي ، لها فعالية عالية في المقاومة الحيوية لأمراض والنبات وذات مستوى ضعيف في نشاط Exteracellular enzume. جميع أفراد هذه المجموعة تنتج مستعمرات ذات قطر أقل من 8 سم على بيئة MEA وتكون جراثيم كونيدية بقطر أكبر من 2.4 ميكروميتر ، تنتج صبغات برتقالية على بيئة تحوي 25% جلسرول آجار .
المجموعة الثالثة Cluster III :
تنتشر هذه المجموعة في الهند وتشمل أرقام 2924 ، 2930 ، 2932 ، 2931. تنتج جراثيم كونيدية أقل من 2.4 ميكروميتر وتعطي ميسيليوم هوائياً على بيئة شبكس أمونيوم آجار ، وعلى نترات آجار وهيدرولايزد جلاتين وتنتج صبغات أرجوانية وتتكشف إلى لون أصفر على بيئة MEA .
إن سلوك عزلات الفطر T.harzianum المختلفة ، في المقاومة الحيوية ، يختلف حسب الفطر المستهدف في المقاومة الحيوية. فمثلاً إن المقاومة الكبيرة التي تحدث للفطر Aphanomyces cochlioides ، تكون بسبب أن هذا الفطر ذو جدر خلوية مكونة السليلوز بالمقارنة مع ما يحدث من تثبيط للفطريات الأخرى مثل R.solani , Phoma beta ، Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersi , Acremonium cucurbiata cearumci والتي تكون ذات جدر خلوية مكونة من الشيتين والجلوكان ، وتكون المقاومة بسبب إنتاج إنزيم السليلوينز من قبل جميع السلالات تقريباً. إن السلالة 2923 التابعة للمجموعة الثانية ، هي العزلة الوحيدة التي لا تثبط نمو الفطر P.betae و R.cochliodes وبالمقابل فإن هذه العزلة تفتقر إلى إفراز البروتين وتظهر أقل مستوى من نشاطات الإنزيمات المحللة ضد الفطريات الأخرى. وبالتالي فإن هذه السلالة لا تعتبر من عوامل المقاومة الحيوية الفعالة ، وبالتالي يمكن القول بأن المستويات المختلفة في المقاومة الحيوية التي يبديها الفطر T.harzianum تعتمد إلى حد ما على نوع العزلة المستعملة في المقاومة .
نظراً للاختلافات الواسعة ضمن الجنس Trichoderma ، فمن الصعب استعمال أسماء معينة للنوع كما ذكرنا سابقاً .
المقاومة الحيوية للجنس Pythium بالجنس تريكوديرما
مقـدمـة :
أنواع الجنس Pythium من بين الكائنات الممرضة الشديدة الخطورة ، والكامنة في التربة مسببة عفن البذور ومرض سقوط البادرات في كثير من المحاصيل على الرغم من الخسائر الاقتصادية الحقيقية المرافقة لأماكن تواجد هذا الجنس ، إلا أن طرق مقاومته كيماوياً صعبة جداً ، وذلك لأن التحكم في الأمراض المتسببة عن الكائنات الكامنة في التربة عن طريق معاملة البذور بالمبيدات الفطرية قد ثبت عدم فعاليته العملية. يعود السبب في ذلك أساساً لظهور سلالات جديدة باستمرار من الفطر Pythium تكون مقاومة للمبيدات الفطرية ، عدا أن هذه الكيماويات تضر بالبيئة ، والأثر المتبقي السام لها في المواد الغذائية سواء بالنسبة للإنسان أو الحيوان. وبالتالي اتجهت جهود العلماء لإيجاد طرق بديلة في مقاومة الأمراض بعيداً عن المبيدات الفطرية ، أهم هذه الطرق البديلة هي المقاومة الحيوية. من أهم الكائنات الدقيقة المستعملة في مقاومة الأمراض الكامنة في التربة هو الفطر Trichoderma. أثبتت التجارب المعملية والحقلية على المقاومة الحيوية ، مقدرة بعض سلالات الفطر المذكور على تخفيض لقاح الفطر Pythium في التربة لغاية مايو سنة 1997 فإن الإجابة الشافية للطريقة التي بواسطتها يشارك التضاد الفطري تشمل التطفل على الفطريات Mycoparsitism والتضاد الحيوي والمنافسة على الموقع والغذاء ، كلها ذكرت بأنها تساهم كثيراً في الإجابة عن التساؤل السابق. إذا وضعنا في عين الاعتبار أن الفطر Pythium يتبع الفطريات البيضية والتي لجدر خلاياها تركيب مميز يحوي B-(1.3)-(1.6)-D-glu-cans وسليلوز بدلاً من الشيتين chitin كمكون أساسي وكبير في الجدار. وبالتالي يمكن أن نتوقع بـأن الـدور الـذي يلعبه إنزيم Glucanases في عملية التضاد الحيوي هو صحيح مائة في المائة .
التفاعل الميسيليومي بين P.ultimum , T.harzianum :
لقد تمت دراسة التفاعل بين هذين الفطرين وذلك كالآتي :
ينمي الفطر Pythium ultimun سلاسة BARR 447 على بيئة PDA ويوضع في حضانة في الظلام على حرارة 26ْم . أما الفطر T.harzianum سلالة (أو عزلة) T.203 تنمي على بيئة PDA وتحضن على حرارة 23 – 25ْم لإجراء التجارب المزدوجة أخذت أقراص PDA (5 ملم قطراً) من أطراف المزرعة الفطرية النامية بقوة من مزرعة T.harzianum وأخرى من مزرعة P.ultimum ووضعت في طبق جديد (فيه بيئة غذائية PDA) على سطح الطبق ، تبعد عن بعضها البعض 3سم ثم حضنت الأطباق على حرارة 25ْم وتحت إضاءة مستمرة. عندئذ فإن الكائن المضاد وعائلة كل منها ينمو باتجاه الآخر. لوحظ بعد 4-5 أيام من تحضين الأطباق ذات المزارع المزدوجة أن هيفات الفطر المضاد T.harzianum تنمو حتى تصل هيفات الفطر الآخر وتنمو عليها. وبعد سبعة أيام لوحظ أن الكائن المضاد كون أعداداً كبيرة من الجراثيم .
الدراسة بالميكروسكوب الإلكتروني :
العينات الميسيليومية المأخوذة (بعد 2 ، 3 ، 4 ، 6 ، 7 أيام من الحقن) من منطقة التفاعل في تجارب المزارع المزدوجة ، أخذت وجهزت للفحص بالميكروسكوب الإلكتروني. لوحظ في العينات المأخوذة بعد يومين من الحقن أن هيفات الفطر المضاد ، قد تم تشخيصها والتعرف عليها بسهولة ، وذلك عن طريق سمك قطرها الأصغر من سمك قطر هيفات الفطر الآخـر الممرض P.ultimum وتكـون ملتفـة حـول خلاياه حيث تحضن الخلايا الرقيقـة الخلايا السميكة .
يكون الالتفاف عادة شديداً ومحكماً حول هيفات الفطر P.ultiumum مؤدية إلى انضغاط شديد لخلايا العائل ، كما هو واضح عن طريق المظهر المتجعد لسطح الخلية. أما في الأطوار المتقدمة من التطفل فإن التفاف الفطر المضاد حول هيفات الفطر الممرض يزداد وتنهار خلايا العائل ويمكن تمييز ذلك بسهولة .
الإجراءات الداخلة في التفاعل بين الفطرين :
أخذت عينات ميسيليومية من منطقة التفاعل بين الفطرين ، وأجريت عليها طرق معملية طويلة (مذكورة في مجلة Applied and Environmental Microbiology الصادرة في مايو 1997 صفحة 2095 إلى 2099) ، وذلك لمعرفة الإنزيمات الداخلة في التفاعل بين الفطرين. بينت الدراسة أنه في العينات المأخوذة من المزرعة بعد يومين من الحقن أن خلايا P.ultimum المحاطة بواسطة هيفات الفطر T.harzianum يحدث فيها تغيرات مهمة تتميز أساساً عن طريق حدوث زيادة في الفجوات وظهور انكماش موضعي في الأغشية البلازمية في المواقع النشيطة لاختراق الكائن المضاد ، عند استعمال التكبيرات الكبيرة يلاحظ أنه في معظم الحالات ، فإن إنكماش الغشاء البلازمي كان مترافقاً مع ترسب نسيج غشائي غير خلوي (Matrix) الذي فيه تركيبات صغيرة الكثافة الإلكترونية مغمورة هذه الترسبات النصف كروية كانت معلمة بكثافة بواسطة المعلمات B-1.4 – exoglucanase gold labeling محاولات الكائن المضاد لاختراق هذه المواد المتكونة جديداً ، نجحت كثيراً وأدت إلى نقص الكثافة على طول قناة الاختراق ، الميكانيكية التي تتحكم في عملية ترسيب السليلوز في مثل هذه المناطق غير واضحة ، مع أن هناك تفسيرين يمكن تقديمهما لذلك .
الأول : المواد المتجمعة يمكن أن تكون قد نشأت من جدار خلية العائل أثناء الانتفاخ ومط مادة البولي ميرز الموجودة مسبقاً. هذا يتطلب بوضوح فعل إنزيم السليوليز المنتج بواسطة الكائن المضاد ، وهذا يمكن أن يقتضى ضمناً نقصاً فيما بعد في المركبات السليولوزية المرتبطة في جدار الخلايا الفطر Pythium. وعلى أية حال فإنه في ذلك الوقت بعد الحقن لم يمكن ملاحظة تغيرات واضحة في جدر خلايا الفطر العائل أو اختلافات معنوية في كثافة معلمات labeling السليلوز ، بالمقارنة مع هيفات الكنترول النامية في مزرعة مفردة.
الثاني : المواد المترسبة يمكن أن تكون قد ترسبت على شكل جزيئات مبنية حديثاً. هذه الاحتمالية تثير سؤالاً هو كيف تستطيع الخلايا الفطرية أن تنظم ترسيب المواد الشبيهة بتركيب الجدار في مناطق غير عادية في الخلية .
البروتينات المرتبطة مع الأغشية مثل الإنزيمات التي تكون متدخلة في بناء مركبات بنائية ، تعرف على أنها مرتبطة مع دهون ، والتي تلعب دوراً كبيراً في تنظيم نفاذية الأغشية البلازمية. التغيرات في تركيب الدهون المتواجدة في الأغشية البلازمية في خلايا الفطر Pythium ، من المحتمل أن تكون ناتجة من فعل مواد سامة منتجة من T.harzianum والتي تحث على نقض تنظيم الإنزيمات المرتبطة بالأغشية ، مؤدية إلى مناطق ذات ترسبات شبيهة بالجدار غير عادية. الدور الحيوي المضبوط للترسبات الغنية بالسليلوز لغاية غير مفهوم ولكن يمكن للباحث أن يتوقع أن التجمعات الكبيرة من المكونات التركيبية في مناطق غير عادية تعكس استراتيجية دفاعية محكمة بواسطة خلايا الفطر Pyhium لمنع اختراق الكائن المضاد .
بمرور 3-4 أيام بعد الحقن (في منطقة التفاعل بين الفطرين) ، تظهر خلايا الفطر Pythium محطمة بشكل كبير وذلك عند قياسها بالتفاعل الكامل و / أو تفجر الغشاء البلازمي غير المنتظم في السيتوبلازم. تبدو جدر الخلايا أسمك منها في الحالة العادية ومعلمة بالتساوي بـGold – complexed exoglucanase باستثناء المناطق التي يحدث فيها اختراق من قبل الفطر Tichoderma. بعد مرور ستة أيام من الحقن ، تبدو هيفات الفطر Pythium (أساسياً) بشكل غير طبيعي ، وعلى شكل قشور pleiomorphic فارغة في الحالات المتقدمة من التطفل ، فإن خلايا الكائن المضاد تتشعب كثيراً في هيفات العائل وتخترق المنطقة التي عادة ما تكون مشغولة بسيتوبلازم العائل. هذا الاستعمار الكثيف ، كثيراً ما يؤدي إلى ضغط ميكانيكي قوي ضد جدر خلايا هيفات العائل. على الرغم من هذا التحطيم الكثيف لخلية العائل ، فإن مناطق ارتباط الـ Exoglucanase لا تزال ظاهرة فوق جدر خلية العائل حتى في المناطق الملاصقة لمناطق الاختراق الفطر. على أية حال فإن التحلل الكمي لـ Labeling يدل على نقص معنوي في كثافة التعليم لطبقات جدار الخلية بالمقارنة مـع تلـك الموجـودة فـي خلايـا Pythium المجموعة بعد يومين من الحقن في المـزارع المزدوجـة.
إن تفكك وارتخاء وحتى انحلال وذوبان الترسبات المتشكلة أولياً بين الأغشية البلازمية المنطوية وجدر خلية العائل ، كانت غالباً مشاهدة في مناطق اختراق Trichoderma ، كما هو موضح عن طريق انطلاق أجزاء عديدة من الذهب على مسافات من منطقة الترسب ، هذا يدل بوضوح على إنتاج كميات كبيرة من Cellulolytic enzymes. وباختبارات أخرى مشابهة ، أثبتت أن بعض صفات التحطيم تظهر أساساً بواسطة التمزق في طبقات الجدار الأكثر بعداً ، الذي يحدث في مناطق جدار العائل المجاورة للاختراق الفطري. وعلى أية حال فإن ما وجد بأن السليلوز المعلم لا يزال متواجداً فوق الجدر المحطمة من الفطر Pythium ، يؤدي إلى القول بأن الإنزيمات المحللة للسيليلوز ليست هي الصفة الحاسمة الوحيدة الداخلة في عملية التضاد. مع أنه يبدو واضحاً أن مثل هذه الإنزيمات تلعب دور المفتاح في كسر جدر خلايا العائل في مناطق محاولة الاختراق ، إلا أنه يبدو محتملاً أن هناك إنزيمات منتجة أخرى ، تشارك أكثر في الطور الترممي للكائن المضاد ، عندما استعملت المركبات الرئيسية المرتبطة بالجدار على شكل مصدر للغذاء للتزويد بالطاقة اللازمة للتكاثر والتجرثم .
بعد سبعة أيام من الحقن ، فإن خلايا الفطر Pythium كانت محطمة كلية ، وفي معظم الحالات هناك كمية قليلة فقط من بقايا الجدار المعلمة كانت دليلاً على الوجود السابق للخلية الفطرية.
جدول : كثافة المعلمات المتحصل عليها مع معقد الذهب glucanase, Exoglucanase فوق جدر الفطر P.ultimum خلال تفاعله مع T.harzianum
| المعاملة | متوسط أعداد الأجزاء الذهبية لكل um2 مع | |
| Exoglucanase-glod | B-1.3-Glucanase gold | |
| كنترول (مزرعة مفردة) بعد يومين من التحضين بعد 3 أيام من التحضين بعد 4 أيام من التحضين بعد 6 أيام من التحضين بعد 7 أيام من التحضين | 94.6 + 14.8 87.8 + 10.3 78.5 + 9.5 60.5 + 12.2 31.8 + 5.3 18.5 + 6.4 | 51.3 + 12.2 22.6 + 10.1 10.3 + 6.4 8.2 + 2.0 1.0 + 0.5 صفر |
بعـد تحضيـن مقاطع من مناطق التفاعل مع المعقد الذهبي لـ B-1.3-glucanase ، حـدث نقص معنوي في جدر خلايا Pythuim المعلمة ، وذلك بعد يومين من الحقن. بعد 3-4 أيام من الحقن فإن التعليم كان منخفضاً إلى شريحة بسيطة من الأجزاء الذهبية فوق طبقات جدار العائل الأكثر بعداً. لوحظ في مناطق اختراق الكائن المضاد انطلاقاً أجزاء ليفية معلمة في المراحل المتقدمة من التضاد (6-7 أيام من الحقن) فإن جدر خلية الفطر Pythium المعلمة بـ B-1.3-glucanase قد اختفت في هذا الوقت بتجرثم الكائن المضاد بكميات كبيرة.
التغير الملاحظ في مكونات B-1.3-glucanase في جدار خلية العائل يكون متناسقاً مع الكفاءة المعروفة للفطر تريكوديرما في إنتاج الإنزيمات Hydrolytic مثل B-1.3-glucanase. أما التغير في B-1.3-glucanase لا يحدث فقط في مناطق الجدار الملاصقة للخلايا تريكوديرما ولكن أيضاً على مسافة من مناطق دخول الكائن المضاد ، وبالتالي فإن B-1.3-glucanase يمكن أن تنتشر بحرية بين الخلايا وهذا ما يسهل للفطر تريكوديرما بالدخول خلال النسيج غير الخلوي المفكك. هذه الملاحظات تثير تساؤلات عن كيفية إضعاف جدار الخلية عن طريق فعل إنزيم B-1.3-glucanase المفرز من قبل تريكوديرما ، وهل يمكن أن تسهل انتشار المركبات السامة باتجاه المستقبلات الغشائية عن طريق زيادة نفاذية الجدار وبالتالي يمكن التأكد على أن الفعل الإنزيمي مع المضادات الحيوية لهما دور فعال في تفاعل المقاومة الحيوية للفطر T.harzianum وبالتالي يمكن القول بأن المقاومة الحيوية التي يقوم بها الفطر المضاد المذكور ضد الفطر الممرض Pythium تعتمد على :
1- إدراك والتصاق الفطر تريكوديرما مع الفطر Pythium ، حيث أن هذا الأخير يشجع إنبات الجراثيم الكونيدية للفطر الأول .
2- إنتاج إنزيمات B-1.3-glucanases التي تضعف جدر خلية العائل ، وإنتاج كمية قليلة من أنزيم السيلوليز لتسمح باختراق موضعي للكائن المضاد.
3- إنتاج مضادات حيوية لتفسد نظام الميتابولزم في العائل.
4- اختراق خلية العائل وإنتاج نشيط لإنزيم السليوليز يؤدي إلى تحطيم خلية الكائن الممرض.
التفاعل الهيفي بين T.harzianum
والفطر Sclerotinia sclerotiorum
مقـدمـة :
يسبب الفطر S.sclerotiorum أمراضاً خطيرة في كثير من المحاصيل ، مثل فول الصويا ، عباد الشمس وكذلك لكثير من نباتات الخضار في المناطق المعتدلة والرطبة ، مع أن الفطر T.harzianum ، ثبت بأنه فعال في منع تكوين الأجسام الحجرية لكثير من الفطريات الممرضة للنبات ، إلا أن ظاهرة التطفل الفطري Mycoparasitism تلعب دوراً مهماً في مقاومة الفطر S.sclerotiorum في حقول التجارب. لقد تم معرفة التفاعل التطفلي بين الفطر تريكوديرما والفطريات الممرضة النباتية الكامنة في التربة باستعمال الميكروسكوب الضوئي والإلكتروني .
تفاعـل الفطريـن :
لقد درس التفاعل الهيفي بين الفطر T.harzianum سلالة (BAFC cult No:72) ، المتطفلة على الفطريات والفطر الممرض النباتي S.sclerotiorum في المزارع المزدوجة وفي التربة المعقمة باستعمال الميكروسكوب الضوئي والإلكتروني. في المزرعة المشتركة فإن هيفات الفطر المضاد تنمو باتجاه وتلتف حول هيفات الفطر الممرض. أما زيادة كثافة لفات هيفات الفطر تريكوديرما والتحطم الأولى لخلايا الفطر الممرض ، فإنها تلاحظ في المراحل المتأخرة من التطفل .
في التربة المعقمة تنبت الجراثيم الكونيدية للفطر T.harzianum (المضاد) وتتكشف إلى ميسيليوم ، وتتصل مع هيفات الفطر الممرض S.sclerotiorum وتشكل تفرعات قصيرة وأجسام شبيهة بأعضاء الامتصاص والتي تساعد في القبض والاختراق لجدر خلية العائل.
هناك نظام قد استعمل في المعمل لاختبار مقدرة الفطر المضاد في مقاومة مرض ذبول Sclerotinia في الخيار والخس ، حيث كانت تغسل بذور الخيار تحت الماء الجاري ثم تطهر بمادة هيبوكلوريد الصوديوم أو في 5% إيثانول ، ثم تغمر بعد ذلك في معلق الجراثيم الكونيدية بنسبة 5 × 10 10 وحدة تكوين مستعمرات / مل من الفطر المضاد T.harzianum ثم تترك لتجف هوائياً وتزرع في بيئة Peat مخلوط بنسبة 100% من الفطر الممرض S.clerotiorum ثم توضع في مراقد الإنبات على حرارة 17مْ لمدة 20يوماً. أما بالنسبة لتجارب الصوبة الزجاجية ، فكانت تمزج التربة التي تزرع فيها بادرات الخس ، بالجراثيم الكونيدية للفطر المضاد بتركيز 3 × 10 10 جرثومة / جرام تربة. كان يستعمل لقاح الفطر الممرض على شكل قطع من الآجار ، الذي يحمل أجساماً حجرية منبتة بنسبة 2 جسم حجري منبت يدفن على عمق 3سم تحت سطح التربة ، وعلى بعد 2سم من جذور البادرات.
إن تغليف البذور بالجراثيم الكونيدية للفطر المضاد ، يؤدي إلى خفض سقوط البادرات قبل وبعد ظهورها فوق سطح التربة المتسبب عن الفطر S.sclerotiorum في الخيار بنسبة 80.69% بالترتيب ، وفي الخس بنسبة 72.46% بالترتيب .
أما في الصوبات الزجاجية فإن المرض المتسبب عن الفطر نفسه في الخس قد انخفض بعاملة البادرات بتحضيرات من التمرس والنخالة نامياً عليها الفطر T.harzianum. وعلى الرغم من عدم الخفض المعنوي لهذا المرض ، إلا أن بادرات الخس المعاملة بالفطر تريكوديرما نمت وتكشفت أفضل من الكنترول. أما في عباد الشمس ، كان هناك خفض معنوي ، بمعدل يتراوح من 68 – 84% في حدوث المرض ، قد تم الحصول عليه عن طريق خلط تحضيرات الفطر المضاد مع التمرس والنخالة ووضعها في منطقة جذور النبات. التطفل الفطري على الهيفات ، كذلك التطفل على الأجسام الحجرية ، هو المقترح في تفسير الميكانيكية التي بواستطها يقاوم الفطر المضاد للفطر الممرض تحت هذه الظروف .
تأثير الفطر المضاد تريكوديرما على الأجسام الحجرية للفطر S.sclerotiorum :
هناك عديد من الكائنات التي تتغذى أو تتطفل على الأجسام الحجرية ، قد درس احتمال كونها عوامل مقاومة حيوية. لقد ذكر Merriman سنة 1976 أن الفطريات Trichoderma , Fusariun sp. , Penicillium sp , sp. وفطريات تربة أخرى تستعمر الأجسام الحجرية للفطر S.sclerotiorum. ولقد ذكر كل من Whipps و Budge سنة 1991 أن الفطريات Sporidesmium sclerotivorum, Gliocladium virens تستطيع أن تحطم الأجسام الحجرية للفطر Sclerotinia sp. وأظهر أدلة على إمكانية استعمالها في المقاومة الحيوية .
لقد ذكر Reeleder و Anas سنة 1987 أن يرقات Braadysia coprophil تحطم الأجسام الحجرية لكثير من الفطريات الممرضة أثناء التغذية ، وبالتالي تؤثر على بقاء الأجسام الحجرية حية وتزيد من قابليتها للإصابة بالكائنات الفطرية. بالإضافة لذلك فإن الأجسام الحجرية التي تأثرت بيرقات الحشرة السابقة يتطفل عليها الفطر T.viride بكثافة أكثر منه في حالة الأجسام الحجرية غير المتأثرة بتغذية اليرقة. وكذلك فإن الإفرازات المغذية لليرقة تخفض من مقدرة الأجسام الحجرية على الإنبات ، هذا يمكن أن يكون بسبب نشاط إنزيم الـ Chitinase في المواد المفرزة. وبالتالي يمكن القول بأن إضافة مجموعات من هذه اليرقات في تربة الحقل يمكن أن تؤدي إلى خفض مدة بقاء الأجسام الحجرية حية في التربة.
وجد في معظم التجارب أن هناك عزلتين من الفطر T.hamatum تسبب تحطيماً كبيراً في الأجسام الحجرية للفطر S.sclerotiorum ، هما TMCS-3 و TMMS-21 والمعزولتين من الطين أو التربة الملوثة بالسماد البلدي. كانت النسبة المئوية للأجسام الحجرية المنبتة منخفضة (صفر و 3%) تحت تأثير العزلتين المذكورتين بالترتيب ، بالمقارنة مع الكنترول 42% كذلك في جميع المعاملات فإن تجرثم الكائن المضاد لوحظ بعد عشرة أيام.
أما بالنسبة لدور يرقات B.coprophila فإن نوع الأضرار التي تسببها للأجسام الحجرية تختلف عن تلك الأضرار التي يسببها الفطر T.hamatum في الطور الأول من التحلل فإن طبقة القشرة من الجسم الحجري تتحطم بواسطة التغذية باليرقة ، بعد ذلك تتغذى اليرقة على طبقة النخاع مسببة أنفاقاً ، حتى يصبح الجسم الحجري كله مستهلكاً أثناء التعذية فإن قطعاً سوداء من قشرة الجسم الحجري تمر خلال الجهاز الهضمي ثم تفرز خارجاً دون أي تحلل يذكر .
وبالمقابل فإن الفطر T.hamatum يخترق القشرة السوداء ويبدأ في التحطيم الكلي للجسم الحجري من الداخل. تبقى القشرة ذات مظهر سليم بصورة عامة دون ظهور أية أعراض للأضرار في البداية ، ولكن الجسم الحجري المستعمر بالفطر يأخذ المظهر المتجعد. إن وجود الفطر T.hamatum يبدو أنه ليس له أية تأثير على سلوك تغذية اليرقة. وعلى أية حال فإن تغذية اليرقة في المرحلة الأولى تبدأ في المناطق التي لم يوطد الفطر تريكوديرما نفسه فيها. لقد وجد أن اليرقة لا تستعمل الفطر تريكوديرما غذاء لها أبداً .
الأجسام الحجرية المعزولة من التربة المعقمة والمعاملة بالفطر تريكوديرما (حيث فقط العزلة TMCS-3 التي استعملت) تبين أنه بين 50 و 100% من سطوحها استعمرت بواسطة الفطر T.hamatum ، أما في التربة غير المعقمة فإن النسبة المئوية للسطح المستعمر كان لا يزيد عن 25% أما عند إضافة يرقات B.coprophila فإن النسبة المئوية لاستعمار السطح لم تزداد معنوياً.
وجد أن الفطر T.viride له تأثير مضاد على Phytophthora cinnamomi .
P. fragariae. P. nicotianae, P. cactorum.
شكرا وبارك الله فيك
ردحذفشكرا
ردحذف